Родился в Уэстон-сапе-Мэйр и получил образование в элитной частной школе для мальчиков в Персе, Кембридж. С 1948 по 1949 служил в образовательном корпусе Королевской армии, изучал математику в Тринити-колледже, Кембридж, который закончил в 1952 г. Получил степень доктора философии (PhD) по физике в 1955 г. под руководством Абдуса Салама в группе, руководимой Полем Дираком. В 1955 женился на Рут Марти и был приглашен в Калифорнийский технологический институт, где продолжил научные исследования вместе с Мюррэем Гелл-Манном. После двух лет преподавания в университете Эдинбурга он вернулся в Кембридж в 1958 г., а в 1968 г. был избран профессором математической физики.
В течение 25 лет Полкинхорн занимался теоретической физикой, работая в области теории элементарных частиц, и играл важную роль в открытии кварков. С 1968 по 1979 г. он был профессором математической физики Кембриджского университета, а в 1974 г. был избран членом Королевского общества. С 1972 по 1981 г. являлся главой руководства элитной школы для мальчиков в Персе.
Полкинхорн начал свое служение в Англиканской церкви в Уэсткотт Хаусе, Кембридж, став англиканским священником в день Св. Троицы 1982 г. в Тринити-колледже, Кембридж. После 5 лет приходского служения Полкинхорн вернулся в Кембридж в качестве декана капеллы Тринити-холла. Затем он стал президентом Королевского колледжа в Кембридже. В 1997 г. он был удостоен звания Рыцаря Ордена Британской империи (KBE); в 1998 стал почетным доктором Даремского университета, в 2002 г. был удостоен премии Джона Темплтона за вклад в исследования в области диалога между наукой и религией.
Полкинхорн является членом Комитета по медицинской этике, Генерального синода Англиканской церкви, Комиссии по вероучению и Комиссии по генетике человека. Он является членом Королевского колледжа в Кембридже и в течение 10 лет каноником кафедрального собора в Ливерпуле. Также он является основателем общества рукоположенных ученых, а также Международного общества по науке и религии. В 1993-1994 гг. Полкинхорн был удостоен права дать престижные Гиффордовские лекции, которые позднее он опубликовал в книге «Вера глазами физика» (The Faith of a Physicist).
Принадлежа к духовенству Англиканской церкви Полкинхорн не использует титул «сэр», хотя он был посвящен в рыцари. Если бы он не был священником, его титул должен был быть следующим: доктор сэр Джон Полкинхорн.
Полкинхорн является автором 30 книг, которые были переведены на 18 языков. 25 из этих книг посвящены вопросам диалога науки и религии и адресованы, главным образом, популярной аудитории.